染色凋亡試劑盒

　　細(xì)胞凋亡是指為維持有機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。正常情況下任何細(xì)胞在形成過(guò)程中發(fā)生的異常都會(huì)通過(guò)凋亡消除。例如體內(nèi)的癌細(xì)胞增長(zhǎng)為腫瘤的過(guò)程會(huì)受細(xì)胞凋亡的引導(dǎo)而被抑制。然而在抑癌基因p53出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，凋亡就不會(huì)誘導(dǎo)發(fā)生，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞的不斷增長(zhǎng)。細(xì)胞凋亡可以通過(guò)細(xì)胞形態(tài)的變化或生物化學(xué)的變化來(lái)檢測(cè)。目前常用的指標(biāo)有caspase活性變化、DNA碎片、磷脂酰絲氨酸的外翻等。

　　染色凋亡試劑盒是一種采用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide ,PI )雙熒光染色方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞壞死分析的檢測(cè)試劑盒。單純的PI染色能夠觀察DNA直方圖上凋亡細(xì)胞的亞G1峰，但只能代表G0/G1期發(fā)生凋亡，無(wú)法觀察S期和G2期發(fā)生的細(xì)胞凋亡，而且細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定后無(wú)法對(duì)活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。Hoechst 33342可以穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞與DNA結(jié)合，能在紫外線下顯示藍(lán)色熒光，而且染色后凋亡細(xì)胞熒光會(huì)比正常細(xì)胞明顯增強(qiáng)。PI不能穿透細(xì)胞膜，對(duì)于具有完整細(xì)胞膜的正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞不能染色。而對(duì)于壞死細(xì)胞，其細(xì)胞膜的完整性喪失，PI可以穿透細(xì)胞膜使壞死細(xì)胞著色產(chǎn)生紅色熒光。

　　檢測(cè)與分析：用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)400～500nm檢測(cè)藍(lán)色熒光，在大于630nm 處檢測(cè)紅色熒光，同時(shí)檢測(cè)光散射情況。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。如果使用熒光顯微鏡檢測(cè)，檢測(cè)前4℃ 1000g 離心3～5min沉淀細(xì)胞，用PBS洗滌一次，再涂片觀察紅色熒光和藍(lán)色熒光。對(duì)于貼壁細(xì)胞使用熒光顯微鏡檢測(cè)，亦可不收集細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后直接依次按照上述比例加入試劑即可。

　　雙染后，可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來(lái)。在二元直方圖上，正常細(xì)胞對(duì)Hoechst 33342具有拒染性，呈弱藍(lán)色熒光+弱紅色熒光（Hoechst 33342+/PI+）；凋亡細(xì)胞對(duì)Hoechst 33342具有嗜染性呈強(qiáng)藍(lán)色熒光+弱紅色熒光（Hoechst 33342++/PI+）；壞死細(xì)胞對(duì)PI具有嗜染性，呈弱藍(lán)色熒光+強(qiáng)紅色熒光。本試劑盒亦可用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，檢測(cè)細(xì)胞含量范圍一般為0.1~1×106之間。

　　染色凋亡試劑盒試驗(yàn)注意事項(xiàng)：

　　1、熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題，建議染色后盡快檢測(cè)。

　　2、在為了獲得細(xì)胞沉淀的離心的過(guò)程中，對(duì)于特殊細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)提高離心力或延長(zhǎng)離心時(shí)間。

　　3、Hoechst 33342與細(xì)胞孵育的時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般控制在20 min以內(nèi)。太長(zhǎng)容易引起Hoechst 33342的發(fā)射光譜由藍(lán)光向紅光遷移，導(dǎo)致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變。