小鼠原代細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)步驟

　　小鼠原代細(xì)胞是從小鼠的特定組織中提取出來的，則可直接得到目的基因不表達(dá)的原代細(xì)胞模型，且與我們?cè)贙O小鼠上的研究具有更好的承接性，從而讓我們想要證實(shí)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康母哂姓f服性。KO小鼠的原代細(xì)胞還可用于細(xì)胞水平的藥物篩選、藥物評(píng)價(jià)等方面。原代細(xì)胞（Primary cells）是指來源活體組織，經(jīng)特定分離方法制備而成的初始細(xì)胞。原代細(xì)胞離體時(shí)間短且不經(jīng)過永生化過程，其生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的遺傳特征，可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)。

　　小鼠原代細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、小鼠麻醉

　　根據(jù)體重計(jì)算相應(yīng)的麻醉劑量并腹腔注射（也可以用異氟烷進(jìn)行空氣麻醉）

　　2、對(duì)*麻醉后的小鼠進(jìn)行解剖，打開腹腔，找到小鼠下腔靜脈及門靜脈，使用滯留針插入下腔靜脈，將50-60ml的緩沖溶液一在10-20min內(nèi)緩慢注射進(jìn)入小鼠血液循環(huán)內(nèi)，看到小鼠肝臟有明顯腫脹時(shí)剪開門靜脈，完成后改用緩沖溶液二進(jìn)行沖洗。

　　3、沖洗完成后，將小鼠肝臟剪下，轉(zhuǎn)移至DMEM高糖培養(yǎng)基，用DMEM培養(yǎng)基清洗2-3次后，使用滅菌鑷子將肝臟在培養(yǎng)基內(nèi)撕開，使原代肝細(xì)胞從肝臟內(nèi)流出。

　　4、將分離得到的肝臟細(xì)胞過篩網(wǎng)篩選，過濾組織碎塊及其他雜質(zhì)，并對(duì)細(xì)胞混懸液離心，按照一定的離心力得到初步的肝細(xì)胞沉淀，此時(shí)的肝細(xì)胞中混雜著肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，需要使用percoll離心液進(jìn)行梯度離心。

　　5、梯度離心后的細(xì)胞即為原代肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，重懸后計(jì)數(shù)即可用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，若對(duì)細(xì)胞純度存疑，也可以進(jìn)行流式測(cè)定。