細(xì)胞攻略 | SK-BR-3(人乳腺腺癌細(xì)胞)培養(yǎng)教程

細(xì)胞基本信息

細(xì)胞正常生長形態(tài)照片

細(xì)胞名稱：SK-BR-3(人乳腺腺癌細(xì)胞)

細(xì)胞別稱 ：SK-Br-3; Sk-Br-3; SK BR 03; SKBR-3; SKBr-3; SK-BR3; SKBr3; SkBr3; SKBR3

細(xì)胞貨號： SNL-058

生長特性 ：貼壁

培養(yǎng)條件 ：1640+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境 ：空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%；37℃

細(xì)胞簡介：  SK-BR-3細(xì)胞是由Trempe·G和Old·L·J于1970年從一位曾接受過放射、類固醇、環(huán)磷酰胺和5-氟尿嘧啶治療的43歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液中分離得到的。SK-BR-3細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)特征包括微絲和橋粒、肝糖原顆粒、大溶酶體、成束的細(xì)胞質(zhì)纖絲；SK-BR-3細(xì)胞過表達(dá)HER2/c-erb-2基因產(chǎn)物，不含病毒顆粒。SK-BR-3細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)和乳腺癌研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。

SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)注意事項

1、形態(tài)多樣

SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)不均一，以鋪路石樣細(xì)胞為主，同時存在部分圓形細(xì)胞，兩種形態(tài)的細(xì)胞皆為貼壁狀態(tài)。

2. 生長較慢

SK-BR-3細(xì)胞生長較緩慢，在1：2傳代的條件下需要培養(yǎng)4-7天可達(dá)到80%密度。請勿頻繁換液和消化，減少觀察頻率，保證細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定。若細(xì)胞生長過慢，可以采用半換液的方式進(jìn)行換液（詳細(xì)步驟見下圖），促進(jìn)細(xì)胞生長。

▲半換液操作示意圖

3. 存在漂浮細(xì)胞

SK-BR-3在培養(yǎng)時存在漂浮細(xì)胞，特別是傳代和復(fù)蘇后，因部分細(xì)胞貼壁較慢，可能存在較多的漂浮細(xì)胞。因此，在傳代和復(fù)蘇后的48小時內(nèi)，不建議對細(xì)胞進(jìn)行任何操作，使細(xì)胞保持靜置狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞更好地貼壁。

若細(xì)胞長期存在大量的漂浮細(xì)胞，請使用臺盼藍(lán)染液檢測漂浮細(xì)胞活性。如果大部分是死細(xì)胞，需及時換液清除；如果大部分是活細(xì)胞，在換液時離心收集，并放回原瓶。

SK-BR-3細(xì)胞傳代方法

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）

2. 抽走培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基，加5mL PBS潤洗1-2遍，清除殘留培養(yǎng)基；3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底，放置培養(yǎng)箱37℃消化；

4. 消化時每隔30s拿出來觀察，鏡下可見細(xì)胞明顯回縮，輕拍培養(yǎng)瓶部分細(xì)胞開始脫落時立即加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，吹落貼壁的細(xì)胞；

Tips：注意控制吹打力度輕柔，吹打次數(shù)不可過多，避免機(jī)械損傷

5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣；

Tips：

1. 推薦傳代比例1:2，細(xì)胞生長至80%密度時傳代，密度過大時易出現(xiàn)漂浮細(xì)胞。

2. 該細(xì)胞傳代后貼壁較慢，傳代后48小時內(nèi)不應(yīng)擾動細(xì)胞。

SK-BR-3細(xì)胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心、棄上清，獲得細(xì)胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置

Tips：

液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

T25培養(yǎng)瓶長滿通?？蓛龃?-3管，10cm皿長滿通?？蓛龃?-4管。

凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

SK-BR-3細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；

2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。

凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù)，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會有差異

4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；

5. 復(fù)蘇24小時后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips：

1. 整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

2. 該細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁較慢，復(fù)蘇后48小時內(nèi)不應(yīng)擾動細(xì)胞。

SK-BR-3細(xì)胞收貨攻略

 ?常溫細(xì)胞

1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多，應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

 ?凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計算的？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個細(xì)胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式。

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細(xì)胞具體消化時間是多久？

每個實驗室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完*規(guī)定消化時間，以實際消化效果和實驗經(jīng)驗為準(zhǔn)。 

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【SNL-058】?SK-BR-3(人乳腺腺癌細(xì)胞)

【SNLM-058】SK-BR-3細(xì)胞專用完*培養(yǎng)基