細胞攻略 | HepG2(人肝癌細胞)培養教程

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▲細胞正常生長形態照片

細胞名稱:HepG2(人肝癌細胞)

細胞別稱: HEP-G2; Hep G2; HEP G2; Hep-G2; HEPG2

細胞貨號: SNL-083

生長特性: 貼壁

培養條件: EMEM(MEM+NEAA)+10% FBS+1% P/S

培養環境: 空氣，95%；二氧化碳 (CO₂)，5%；37℃

細胞簡介: HepG2細胞是從患有肝癌的15歲白人男性青年的肝細胞癌中分離出來，細胞表達甲胎蛋白、白蛋白α2-巨球蛋白、α1抗胰蛋白酶、轉鐵蛋白、α1抗胸腺蛋白酶、結合珠蛋白、銅藍蛋白、纖溶酶原補體（C4）、C3活化劑、纖維蛋白原、α1酸性糖蛋白、α2-HS糖蛋白、β-脂蛋白、視黃醇結合蛋白等基因。HepG2細胞表達標志物包括胰島素；胰島素樣生長因子II（IGF II）。HepG2細胞表現3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性，對葛蘭素酮（氧化應激）的刺激表現為apoA-I mRNA表達減少、過氧化氫酶mRNA表達增加。沒有證據表明HepG2細胞中存在乙型肝炎病毒基因組。除了基于原始出版物（PubMed:6248960）的所稱的肝細胞癌或肝癌細胞系外，HepG2也被稱為肝母細胞瘤細胞系（PubMed:19751877）。HepG2細胞系由Wistar研究所保藏，是合適的轉染宿主。

HepG2細胞培養注意事項

1、空泡現象

HepG2細胞中常有空泡，這是該細胞正常特性，不影響細胞生長，無需擔心。

2、細胞生長慢

培養條件適宜的情況下，在T25培養瓶中生長的HepG2細胞，以1:2傳代后，培養2-3天可以到達80%匯合率。若細胞生長過慢甚至不生長，可將血清增加至15%-20%（不要超過20%），待細胞恢復生長速度后再將血清比例降低到10%。

細胞接種密度不可過低，否則生長非常緩慢。

3、細胞聚團或不貼壁

血清品牌和培養基pH是影響HepG2細胞貼壁性的關鍵因素。

通常HepG2細胞呈單層生長，但遇到不合適的血清細胞可能呈現聚集傾向，最終聚團且不易消化開；也可能貼壁性變弱，漂浮細胞變多。使用高質量低內毒素未滅活的胎牛血清，可以幫助細胞更好地貼壁及形成單層細胞。

pH過高過低都將影響細胞貼壁性，每天觀察培養器皿中培養基的顏色，偏黃及時換液，偏紫時檢查培養箱CO2供應是否正常，培養瓶是否透氣，并及時換液。

4、漂浮細胞多

排除上文中提到的血清和pH對細胞貼壁的影響，傳代或復蘇后若有部分細胞漂浮，是正常現象，隨著培養部分漂浮細胞會逐漸貼壁。漂浮細胞較多時不要扔，使用臺盼藍檢查細胞活性，若大部分是活細胞，將這些細胞離心收集后重新接種至原瓶。增加血清量（總比例不超過20%）可以促進貼壁。

消化時需注意時間不能太長，第一次消化該細胞要摸索最佳時間（操作見后文）。中和時輕柔吹打，控制吹打次數和力度，可有效減少傳代后漂浮細胞。

5、有圓形細胞粘附在貼壁的單層細胞上

這在HepG2培養時是常見現象，這些細胞可能是尚未完*貼壁或者正處于分裂期的細胞，無需對此特殊處理。

HepG2細胞傳代方法

1. 準備所需的培養基、胰酶、PBS、離心管、培養瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預熱）

2. 抽走培養瓶內培養基，加5mL PBS潤洗1-2遍，清除殘留培養基；

3. 盡量吸干潤洗的PBS后加1mL胰酶，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底，放置培養箱37℃消化；

4. 消化時每隔1min拿出來觀察，鏡下可見細胞明顯回縮，輕拍培養瓶部分細胞開始脫落時立即加入3-4mL含血清的培養基終止消化，吹落貼壁的細胞；

Tips：注意控制吹打力度輕柔，吹打次數不可過多，避免機械損傷

5. 將細胞懸液轉移至離心管中，1000rpm，3min離心收集細胞；

6. 在新的培養瓶中加入適量新鮮培養基；（T25推薦10mL，T75推薦15mL）

7. 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養基輕輕重懸吹散細胞，將細胞懸液均勻接種至培養瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養箱中繼續培養，注意培養瓶蓋透氣；

Tips：推薦傳代比例1:2-1:4，首*傳代建議1:2。細胞生長至80%密度時即可傳代。

HepG2細胞凍存方法

1. 配制程序性凍存液，準備相應數量凍存管并做好標記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養基+8%DMSO

2. 先將細胞按傳代步驟消化、離心、棄上清，獲得細胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至凍存管中；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

5. 轉移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置

Tips：

液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存。

程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請按產品說明書處理降溫過程。

T25培養瓶長滿通常可凍存2-3管，10cm皿長滿通常可凍存3-4管。

凍存密度低將導致復蘇后細胞狀態不佳。

HepG2細胞復蘇方法

1. 提前將水浴鍋預熱至37℃，培養基復溫至室溫或37℃，離心機設置好轉速；

2. 將細胞從液氮罐取中出，觀察管內無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

若液氮或冰箱距離細胞房較遠，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房。

凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大。水浴前一定要觀察管內是否存在液氮，若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發后再水浴。做好防護，避免凍存管炸開導致受傷。

水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機具體轉速會有差異

4. 離心完成后棄上清，用預熱的培養基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細胞后接種至培養瓶中，輕輕混勻后放入培養箱；

5. 復蘇24小時后觀察細胞貼壁情況。

Tips：

1. 整個細胞復蘇過程在盡可能5-10min內完成。

2. 該細胞貼壁需要穩定的環境，復蘇完成后請勿頻繁將細胞拿出觀察。

HepG2細胞收貨攻略

常溫細胞

1. 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置4h以上；

2.吸走大部分培養基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續培養至細胞密度80%以上再進行傳代培養；

凍存細胞

1. 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完*揮發建議立即復蘇細胞并聯系銷售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時聯系銷售人員，在專業技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完*揮發等異常情況時，及時拍照聯系銷售人員；

2. 尚恩生物T25瓶發貨的細胞內含對應細胞的完*培養基，可以收集原裝培養瓶內培養基經1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

常見問題及解決方案

細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現細胞狀態的一種方式。

NO.2培養過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完*培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞，再離心后，用完*培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細胞具體消化時間是多久？

每個實驗室用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完*規定消化時間，以實際消化效果和實驗經驗為準。 

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