細胞攻略 | 3D4/21(豬巨噬細胞)細胞培養教程

細 胞 基 本 信 息

細胞正常生長形態照片

細胞名稱：3D4/21(豬巨噬細胞)

細胞別稱： IPAM-WT

細胞貨號： SNL-486

生長特性： 貼壁

培養條件： DMEM+10% FBS+1% P/S

培養環境： 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

細胞簡介： 3D4/21細胞的親代豬單核細胞系3D4于1998年12月用帶新霉素抗性基因和SV40大T抗原的pSV3neo質粒轉染原代豬肺泡巨噬細胞培養物后建立。3D4細胞系在G-418存在下通過單細胞克隆和選擇獲得了3D4/2、3D4/21和3D4/31細胞，這三種克隆擁有不同程度的非特異性酯酶活性和吞噬作用，具體活性取決于培養基配方。克隆3D4/21可產生牛腺病毒3型（BAV-3），其滴度明顯高于克隆3D4/2和3D4/31。與其他克隆相比，添加DMSO提高了克隆3D4/21復制非洲豬瘟病毒（ASFV/Lillie）野生分離株的能力。3D4/21細胞可以用于3D細胞培養和免疫學研究。

3D4/21(豬巨噬細胞)特點

細胞貼壁較強

由于細胞本身屬于巨噬細胞類，細胞貼壁比較強，消化時易出現消化時間偏長現象，注意一定要消化到細胞可以輕輕吹下，再吸取正在消化的胰酶盡量吹下貼壁的細胞，最后加終止液終止消化，若先加終止液再吹打細胞可能會重新貼壁導致無法吹下以至于收集不到足夠細胞；

細胞顆粒比較多

該細胞培養過程中代謝會產生較多顆粒物，細胞內部及細胞周邊可以明顯看到很多顆粒，此為該細胞正常現象，并不代表細胞狀態不佳或污染；消化操作不規范、培養條件不適等會導致細胞顆粒進一步增加，嚴重的可能會出現細胞不長甚至死亡，對環境和操作要求偏高；

細胞顆粒較多時可以收集細胞后低速離心并用PBS重懸后再低速離心，重復1-2次后再接種到新的培養瓶中；

細胞消耗培養基偏快

細胞培養基消耗速度偏快，必須多加點培養基培養細胞，T25瓶加10-12ml完*培養基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次；

細 胞 收 貨 攻 略

常 溫 細 胞

1. T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養箱靜置4h以上；

2. 吸走大部分培養基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態照片，觀察細胞密度，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續培養至細胞密度80%以上再進行傳代培養；

凍 存 細 胞

1. 細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內復蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完*揮發建議立即復蘇細胞并聯系銷售人員解決；

2. 凍存細胞建議盡快復蘇一管培養檢查，以免超出售后期，復蘇步驟參考復蘇攻略；

3. 復蘇一管細胞出現異常及時聯系銷售人員，在專業技術支持的指導下進行下一步操作；

Tips：

1. 細胞收貨出現漏液、培養瓶破損、干冰完*揮發等異常情況時，及時拍照聯系銷售人員；

2. 該細胞運輸過程中由于條件不適，顆粒可能會增多，一定要充分平衡細胞后再處理，有條件的建議放培養箱過夜再處理細胞；

3. 尚恩生物T25瓶發貨的細胞內含對應細胞的完*培養基，可以收集原裝培養瓶內培養基經1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續細胞培養；

細 胞 傳 代 攻 略

1. 先盡量吸干凈T25瓶原培養基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

2. T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動培養瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養瓶放入37度培養箱消化；

3. 消化到細胞間隙變大，但未完*脫落時吸取正在消化的胰酶先輕輕吹下細胞，再加2-3ml完*培養基終止胰酶消化；

4. 混勻細胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

5. 加新的完*培養基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養瓶里，補足完*培養基，將培養瓶放回培養箱靜置培養；

Tips：

1. 該細胞對消化時間偏長，注意略微延長消化時間；

2. 對于消化細胞程度，客戶如果經驗不多，無法準確掌控胰酶作用時間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復溫到室溫后加入細胞，放入37度培養箱，然后每隔30秒，即吹打下細胞（此時吹打細胞應盡量輕柔，不能強行將細胞吹下，否則細胞可能出現機械損傷），如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復操作直至能夠輕柔的吹下細胞；

3. T25瓶加10-12ml完*培養基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。

4. 細胞收貨后首*傳代建議按1：2傳代，后續培養可以視具體細胞生長狀態和密度情況決定傳代比例；

5. 傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞；

細 胞 凍 存 攻 略

凍 存 步 驟

1. 先將細胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細胞上清，獲得細胞沉淀；

2. 加入適量預先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞，并將細胞懸液轉移至做好標記的凍存管中；

3. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

4. 轉移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置，液氮保存24h后建議復蘇一管檢測凍存細胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips：

1. 檢測凍存細胞活性結果未合格前，培養瓶內細胞建議繼續培養直至確認凍存合格方可視需要丟棄；

2. 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產品說明書處理降溫過程；

3. T25培養瓶長滿通常可以凍存2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；

細 胞 復 蘇 攻 略

復 蘇 步 驟

1. 將所需的完*培養基放在培養箱預熱30min后開始復蘇；

2. 準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出，觀察管內無液氮的情況下，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；

3. 將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機具體轉速會有差異；

4. 離心完成后棄凍存液，用剛才預熱的培養基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養箱；

5. 24h后觀察細胞并換液一次，放回培養箱繼續培養；

Tips：

1. 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大，水浴前一定要觀察管內是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會待液氮完*蒸發后再水浴；

2. 水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導致污染的概率；

3. 水浴至剩米粒大小時及時終止水浴，避免過度水浴或水浴時間不足；

4. 建議水浴完成后直接在離心管內離心細胞，避免再次轉移細胞；

5.復蘇后的細胞比較脆弱，吹打和轉移細胞時盡量輕柔，復蘇24h后換液去除死亡細胞；

# 常見問題及解決方案#

*.1細胞密度怎么計算的？

嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數細胞數量，但在實際培養過程中，并不需要為了精確控制細胞數量而消化細胞計數。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養容器底部，有細胞的區域占總區域的百分比值，當然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導致并不嚴謹，但也是相當直觀、簡便的表現細胞狀態的一種方式；

NO.2培養過程中細胞碎片較多怎么處理？

1. 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細胞都會有這種現象，只是不同細胞顆粒多少有區別，細胞培養體系不適應、營養缺乏、滲透壓異常等均可能導致細胞內顆粒增加，建議使用合適的培養條件。

2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產物，可以先吸走培養基后用PBS潤洗清除，再加新的培養基繼續培養。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞，消化完成后加完*培養基終止消化，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后，用完*培養基重懸接種到新的培養皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細胞具體消化時間是多久？

每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完*規定消化時間，以實際消化效果和客戶經驗為準。 

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