細(xì)胞攻略 | 293T(人胚腎細(xì)胞)細(xì)胞培養(yǎng)教程

細(xì) 胞 基 本 信 息

▲細(xì)胞正常生長形態(tài)

細(xì)胞名稱： 293T(人胚腎細(xì)胞)

細(xì)胞別稱： Hek293T; HEK-293T; HEK 293T; HEK-293-T; HEK 293 T; 293-T; 293 T; 293T; Human Embryonic Kidney 293T; 293tsA1609neo

細(xì)胞貨號(hào)：SNL-015

生長特性： 貼壁

培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%；二氧化碳 (CO2)，5%

細(xì)胞簡(jiǎn)介： 293T細(xì)胞最初稱為293tsA1609neo，是293 [HEK-293]細(xì)胞株插入了SV40 T-antigen的溫度敏感基因形成的高轉(zhuǎn)衍生株。293T細(xì)胞能夠復(fù)制攜帶SV40復(fù)制區(qū)的載體，當(dāng)用于生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒時(shí)，會(huì)產(chǎn)生高滴度病毒。293T細(xì)胞已廣泛用于逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)、基因表達(dá)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。

293T(人胚腎細(xì)胞)細(xì)胞特點(diǎn)

01細(xì)胞貼壁較弱

細(xì)胞貼壁比較弱，因此在遇到運(yùn)輸?shù)蜏丶罢鹗帯⑹覝仂o置太長時(shí)間、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷、密度較高、聚集未吹散、加液吹打到細(xì)胞面等情況時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的成片脫落現(xiàn)象，此時(shí)若脫落現(xiàn)象不嚴(yán)重應(yīng)盡快放回培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，若呈大片脫落的情況時(shí)需要收集細(xì)胞重新消化吹散并接種；

建議使用經(jīng)過包被或者高貼壁培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，盡量避免接觸低溫或密度過高；

02細(xì)胞本身偏嗜酸性，消耗培養(yǎng)基較快

細(xì)胞在略微偏酸性的環(huán)境下生長狀態(tài)會(huì)比偏堿性的好，注意培養(yǎng)基pH控制；

細(xì)胞密度達(dá)到70%以上時(shí)，培養(yǎng)基消耗會(huì)很快，主意及時(shí)觀察并換液；

03細(xì)胞生長聚集成島狀

細(xì)胞呈島狀聚集生長，逐步向外側(cè)擴(kuò)散直至融合；

04細(xì)胞聚團(tuán)后很難再吹散

細(xì)胞傳代過程中一定要注意吹散細(xì)胞，接種密度不要過高，否則接種后細(xì)胞聚團(tuán)將很難再吹散，會(huì)形成類似球狀的聚集體貼壁生長，培養(yǎng)條件合適的情況下細(xì)胞會(huì)逐漸攤開生長，但若培養(yǎng)條件無法有效促進(jìn)細(xì)胞貼壁，可能會(huì)長時(shí)間呈球狀增殖；

細(xì) 胞 收 貨 攻 略

常溫細(xì)胞

1. T25瓶收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2-4h；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；

2. 該細(xì)胞貼壁生長，T25瓶運(yùn)輸過程中經(jīng)常出現(xiàn)大量細(xì)胞脫落并聚團(tuán)的情況，細(xì)胞脫落建議按以下步驟處理：

收貨發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脫落聚集，可以將所有細(xì)胞收集起來，在50ml離心管內(nèi)離心，上清保存?zhèn)溆茫儆肞BS重懸細(xì)胞，盡量吹散后離心棄上清。沉淀用1ml胰酶重懸，放37度消化2min，先輕輕吹散細(xì)胞，再加4ml左右培養(yǎng)基終止消化吹散細(xì)胞至無肉眼可見團(tuán)塊，離心棄上清，加第一步保存的培養(yǎng)基重懸后接種到新的培養(yǎng)瓶。由于貼壁較弱細(xì)胞消化時(shí)間本身較短，注意必須控制消化時(shí)間和吹打力度，避免細(xì)胞消化或吹打死亡過多導(dǎo)致無法正常貼壁生長。由于運(yùn)輸會(huì)脫落的細(xì)胞本身貼壁較弱，建議使用高貼附培養(yǎng)瓶或提前包被過的培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞。

3. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

細(xì) 胞 傳 代 攻 略

1.先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細(xì)胞10-20s，吸走潤洗的PBS；

2.T25瓶加1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；

3. 消化到細(xì)胞間隙變大，但未脫落時(shí)加2-3ml培養(yǎng)基終止胰酶消化；

4.混勻細(xì)胞，900rpm離心3-5min，棄上清；

5.加新的培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補(bǔ)足培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

Tips：

1. 對(duì)于消化細(xì)胞程度，客戶如果經(jīng)驗(yàn)不多，無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時(shí)間，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細(xì)胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔30秒，即吹打下細(xì)胞（此時(shí)吹打細(xì)胞應(yīng)盡量輕柔，不能強(qiáng)行將細(xì)胞吹下，否則細(xì)胞可能出現(xiàn)機(jī)械損傷），如果能夠吹打散細(xì)胞，說明細(xì)胞消化完成可以終止消化，如果30秒吹打不下，再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細(xì)胞；293T細(xì)胞貼壁較弱，所以消化時(shí)間會(huì)比常規(guī)貼壁細(xì)胞短很多，注意控制消化時(shí)間；

2. T25瓶加10-12ml培養(yǎng)基，10cm皿加12-15ml，2-3天換液一次。

3. 細(xì)胞收貨后傳代建議按1：2傳代，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細(xì)胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例；

4. 傳代后24h建議觀察細(xì)胞并換液一次去除死亡細(xì)胞；

細(xì) 胞 凍 存 攻 略

(凍存步驟)

1. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化、離心，至傳代步驟4，棄細(xì)胞上清，獲得細(xì)胞沉淀；

2. 加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標(biāo)記的凍存管中；

3. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

4. 轉(zhuǎn)移細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置，液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存；

Tips：

1. 檢測(cè)凍存細(xì)胞活性結(jié)果未合格前，培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認(rèn)凍存合格方可視需要丟棄；

2. 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程；

3. T25培養(yǎng)瓶長滿通常可以凍存2-3管，10cm皿長滿可以凍存3-4管；

細(xì) 胞 復(fù) 蘇 攻 略

(復(fù)蘇步驟)

1. 將所需的培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇；

2. 準(zhǔn)備37度溫水，將細(xì)胞從液氮罐取中出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃，融化至米粒大小冰塊，終止水浴；

3. 將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心1-2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異；

4. 離心完成后棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，并輕柔重懸細(xì)胞后接種至T25或者10cm皿中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；

5. 24h后觀察細(xì)胞并換液一次，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；

Tips：

1. 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮建議靜置一會(huì)待液氮蒸發(fā)后再水浴；

2. 水浴時(shí)可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；

3. 水浴至剩米粒大小時(shí)及時(shí)終止水浴，避免過度水浴或水浴時(shí)間不足；

4. 建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細(xì)胞，避免再次轉(zhuǎn)移細(xì)胞；

5. 復(fù)蘇后的細(xì)胞比較脆弱，吹打和轉(zhuǎn)移細(xì)胞時(shí)盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細(xì)胞；

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式；

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5ml PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。

NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？

每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。

NO.4細(xì)胞培養(yǎng)瓶是怎么包被的？

細(xì)胞培養(yǎng)瓶包被方法有很多，例如多聚賴氨酸、明膠、鼠尾膠原等，不同的包被原理和效果都不太一樣，具體可以根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)室條件選擇合適的包被材料。注意包被后應(yīng)及時(shí)使用，包被后放的時(shí)間越長效果越來越差的。

市面上也有特殊處理的培養(yǎng)瓶可以選擇，常規(guī)TC處理或者corning的cellbind型號(hào)培養(yǎng)瓶都是不錯(cuò)的選擇。

NO.5 細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)聚團(tuán)現(xiàn)象怎么處理？

細(xì)胞傳代過程中建議盡可能吹散細(xì)胞，并在顯微鏡下確認(rèn)細(xì)胞基本分散后再接種細(xì)胞；

細(xì)胞培養(yǎng)建議使用優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)體系并保證溫度、濕度、二氧化碳濃度適宜，能有效避免細(xì)胞吹散后在貼壁時(shí)再聚團(tuán)的現(xiàn)象， 也可以減輕細(xì)胞聚團(tuán)后無法重新攤開生長的癥狀；

培養(yǎng)過程中輕微聚團(tuán)可以稍微延長消化時(shí)間并在消化終止后將細(xì)胞懸液靜置1-2min，讓大團(tuán)細(xì)胞下沉后盡量吸取上層的分散細(xì)胞傳代，聚團(tuán)過于嚴(yán)重的建議重新培養(yǎng)或者更換培養(yǎng)體系；

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【SNL-015】 293T(人胚腎細(xì)胞)

【SNLM-015】293T細(xì)胞專用培養(yǎng)基