l02細胞進行復蘇的原則及步驟

　　l02細胞復蘇的原則：快速融化：需要將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

　　（一）實驗前準備：

　　1、將水浴鍋預熱至37℃

　　2、用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。

　　3.、在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等4、將RPMI1640培養液、胎牛血清、從4℃冰箱拿出5、配制適量含10%的胎牛血清及青蓮霉素混合液（1×）的*培養液放入4℃冰箱內備用。

　　（二）細胞復蘇：

　　1.取液氮中凍存細胞，于37C水浴鍋中不斷的搖動，使管中的液體在1min內迅速融化，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，拿入超凈臺內，將凍存管內細胞吹打混勻后吸入10m1離心管內，緩慢加入5-8ml含胎牛血清和青鏈霉素的*培養液。

　　2.離心機內配平離心，1000r/min離心5min，吸棄上清液，將剩余細胞吹打混勻制成懸液轉移入培養瓶內，加入*培養液6ml，將培養瓶放入37℃和5%C02的培養箱內孵育。

　　l02細胞消化及傳代：

　　1.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。

　　2.小心吸出舊培養液，用PBS沖洗兩遍后，加入適量消化液（EDTA胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞。顯微鏡下觀察細胞：若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。

　　3.加入5ml培養液終止消化，用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機中，以1000轉/分鐘離心5分鐘。